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合作文章丨J Pharm Anal�；鈮A定量方法開發(fā)
�；鈮A主要來源于線粒體、過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的脂肪酸和支鏈氨基酸。根據(jù)酰基鏈長(zhǎng)度可分為短鏈(C2-5)、中鏈(C6-12)、長(zhǎng)鏈(C13-20)和超長(zhǎng)鏈(> C20)�；鈮A，其中部分�；鈮A的�；溕虾辛u基、羧基或側(cè)鏈甲基，或與許多親水性化合物（包括氨基酸、葡萄糖醛酸和磺酸）共軛。這些�；鈮A不僅在脂質(zhì)和氨基酸的代謝穩(wěn)態(tài)、脂肪酸運(yùn)輸和宿主-微生物共生等方面發(fā)揮著重要作用，而且部分�；鈮A作為2型糖尿病、心血管疾病、阿爾茨海默病、非酒精性脂肪性肝病、腫瘤和先天性代謝缺陷的生物標(biāo)志物。然而，各種�；鈮A的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)存在巨大差異，目前仍然缺乏高通量高覆蓋的�；鈮A定量方法用于支鏈、羥基化、羧化和共軛酰基肉堿的功能研究。
超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS）在同時(shí)定性定量酰基肉堿方面具有巨大的潛力。超高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜法（UPLC-HRMS）受限于掃描速度和動(dòng)態(tài)范圍，故對(duì)于含有多不飽和、羥基化和羧化酰基鏈的低豐度�；鈮A具有較低的定性定量準(zhǔn)確性。相對(duì)地，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）目前作為超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）定量分析的最佳選擇，存在熱不穩(wěn)定性、覆蓋度低、通量低或異構(gòu)體區(qū)分有限等問題。因此，所有報(bào)道的UPLC-MS/MS方法只覆蓋了少數(shù)羥基化和羧化的�；鈮A，而沒有共軛的酰基肉堿。此外，基于UPLC-MS/MS的高覆蓋酰基肉堿定量方法的主要瓶頸之一是缺乏可靠的標(biāo)準(zhǔn)品來獲得所有可能的�；鈮A的保留時(shí)間（tR）。然而，定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系（QSRR）建模雖然有助于預(yù)測(cè)酰基肉堿tR，但這類研究只考慮了�；溕系奶荚雍碗p鍵數(shù)量。
復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院分子表型代謝組平臺(tái)唐惠儒教授團(tuán)隊(duì)首先開發(fā)了一種基于UPLC-MS/MS結(jié)合MRM采集模式的定量方法，可用于在10分鐘內(nèi)同時(shí)定量生物體液和組織中所有可識(shí)別的�；鈮A。然后，利用�；鈮A7個(gè)結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建了其tR值的QSRR模型用于預(yù)測(cè)更多�；鈮A的tR值，從而進(jìn)一步建立了文獻(xiàn)中檢測(cè)到的1136種�；鈮A的MRM參數(shù)（tR、MRM離子對(duì)與碰撞能量值）數(shù)據(jù)庫。最后，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步定量了兩種典型人體生物體液（血漿和尿液）和五種典型動(dòng)物模型組織中的�；鈮A，以揭示其分子表型特征。
研究方法
首先，采用異丙醇/水溶液提取不同生物基質(zhì)中�；鈮A。再者，采用UPLC-QTOFMS定性分析�；鈮A標(biāo)準(zhǔn)品的tR與特征碎片，并鑒定出不同生物基質(zhì)中�；鈮A種類。然后，基于R語言中LM函數(shù)來構(gòu)建�；鈮AtR值的QSRR預(yù)測(cè)模型、并建立文獻(xiàn)中檢測(cè)到的1136種酰基肉堿的MRM參數(shù)（tR、MRM離子對(duì)、碰撞能量）數(shù)據(jù)庫。最后，經(jīng)方法學(xué)考察，對(duì)多種生物基質(zhì)中�；鈮A進(jìn)行定量分析與分子表型描述。
研究?jī)?nèi)容
1. 基于UPLC-QTOFMS多種基質(zhì)�；鈮A分析
相比負(fù)離子模式，在正離子模式下所有�；鈮A均產(chǎn)生更強(qiáng)烈的信號(hào)，包括母離子[M]+（源于左旋肉堿季銨陽離子）、[M-59.0735]+（N(CH3)3的中性損失）和來自左旋肉堿部分的三個(gè)特征碎片（m/z 144.1019、85.0284和60.0808）。同時(shí)，所有共軛�；鈮A均產(chǎn)生母離子[M]+、[M-共軛物-59.0735]+和來自肉堿部分的三個(gè)特征碎片。由于特征碎片m/z 85.0284響應(yīng)值均最強(qiáng)，故 [M]+/85.0284可作為酰基肉堿的MRM定量離子對(duì)。[M-共軛物-59.0735]+是共軛酰基肉堿唯一的高響應(yīng)特征碎片，故[M]+/[M-共軛物-59.0735]+可用于作為定量MRM離子對(duì)�；谏鲜鯩RM定性定量分析方法，多種生物基質(zhì)（兔肝組織、人源血漿、尿液和細(xì)胞）及其混合樣品中鑒定出471種�；鈮A，其中包括395種�；鈮A和76種共軛�；鈮A。
圖1 （A）�；鈮A（C10:0）與（B） N -乙酰半胱氨酸共軛-羥基�；鈮A（N-acetylcys-C10:1-OH-CA）在正離子模式下的碎裂模式。
2. 酰基肉堿定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(QSRR)和MRM參數(shù)數(shù)據(jù)庫
利用R語言中LM函數(shù)構(gòu)建了該色譜條件下�；鈮A的QSRR模型（式3），45種�；鈮A標(biāo)準(zhǔn)品的計(jì)算保留時(shí)間（tRC）與實(shí)驗(yàn)結(jié)果（tRE）具有良好的線性相關(guān)性（r2> 0.998）和準(zhǔn)確性（△tR< 0.20 min，MAE < 0.07 min）。該模型對(duì)于混合樣品中檢測(cè)到的所有211個(gè)酰基肉堿均具有良好的tRC與tRE相關(guān)性（r2 ~ 0.984）和預(yù)測(cè)精度（MAE< 0.21 min和△tR < 0.9 min），其中包括不同�；兼�、支鏈甲基、碳碳雙鍵、羥基或羧基數(shù)目的�；鈮A。即使在這些結(jié)構(gòu)特征同時(shí)存在的情況下，從混合樣品中鑒定出97%�；鈮A的tRC與tRE相關(guān)性和準(zhǔn)確性均優(yōu)�；诖耍粋�(gè)MRM參數(shù)（tR、MRM離子對(duì)和碰撞能量）數(shù)據(jù)庫被進(jìn)一步建立，其中涵蓋了含398個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)式的1136種酰基肉堿（包括�；鈮A、共軛肉堿及其異構(gòu)體）。
tRC = k0 + k1c3 + k2c2 + k3c + k4b+ k5d + k6h + k7j+ k8p + k9q+ k10ch (式 3)
（其中，k0 = –0.252, k1 = 8.54×10–4, k2 = –4.82×10–2, k3 = 1.06, k4 = –0.487, k5 = –0.172, k6 = –1.65, k7 = –1.55, k8 = 0.152, k9 = –1.59×10–2與k10 = 7.20×10–2。模型中變量c、b、d、h、j分別表示�；溙�、支鏈甲基、碳碳雙鍵、羥基、羧基的個(gè)個(gè)數(shù)，p、q表示支鏈和雙鍵的位置。）
圖2（A）45個(gè)�；鈮A標(biāo)準(zhǔn)品與（B）生物樣品中檢測(cè)到的�；鈮A模型計(jì)算保留時(shí)間（tRC）與實(shí)驗(yàn)結(jié)果（tRE）的比較。
3. 多種生物基質(zhì)中�；鈮A的定量分析以表征其分子表型
在2種典型的人源生物液體（血漿和尿液）和5種小鼠組織（腎臟、肝臟、心臟、肺和肌肉）中共定量出514種�；鈮A，用于表征其酰基肉堿分子表型。其中，人源尿液樣本中含有421種�；鈮A多于人源血漿（149種）和小鼠組織（包括腎211種、肝195種、心臟189種、肺188種與肌肉169種），特別是共軛�；鈮A與含有羥基和羧基的酰基肉堿。
圖3 多種生物基質(zhì)中不同類型的飽和（sAC）、不飽和（uAC）、羥基化（AC-OH）、羧化（AC-DC）與共軛酰基肉堿（CAC）的濃度（c）。其中粗線（sum）與細(xì)線表示每類總濃度與每種濃度分布。
全文總結(jié)
建立的高通量UPLC-MS方法可實(shí)現(xiàn)多種生物基質(zhì)中數(shù)百種酰基肉堿和共軛�；鈮A的定量分析。同時(shí)，構(gòu)建的定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系模型，可用于無標(biāo)準(zhǔn)品條件下�；鈮A的tR值預(yù)測(cè)。最后，該定量方法通過量化2種人源生物體液與5種小鼠組織中500多種酰基肉堿，不僅為這些生物基質(zhì)的分子表型提供了數(shù)據(jù)，也為大型隊(duì)列疾病研究提供了一種重要且可靠的分析技術(shù)。多種生物基質(zhì)的高通量高覆蓋�；鈮A定量方法于2023年10月發(fā)表在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域期刊J Pharm Anal上(online)。
