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干貨分享丨血漿/血清/紅細(xì)胞中葉酸檢測
在科研工作中，你是不是也曾被這個問題困擾？
在調(diào)研文獻(xiàn)的時候，明明都是測葉酸，有的文獻(xiàn)是測血漿，有的是血清，甚至還有測紅細(xì)胞的？到底哪種樣品類型最合適？
好不容易確定了這個問題，檢測方又拋出了一個新問題，是要測普通葉酸？還是測活性葉酸？大腦CPU都要被燒干了，這兩者又有什么區(qū)別？
接下來，我們用最具學(xué)術(shù)精神的回答，溯源每個問題的本真。
各種類型血樣的定義？制備？
歡迎參考我們前面發(fā)表的一篇文章《干貨分享丨全血/血漿/血清/紅細(xì)胞中脂肪酸檢測》，但是葉酸跟脂肪酸不同的是，臨床和科研中，關(guān)于不同樣本類型中葉酸的檢測，范圍和定義差別居然很大。
如何制備這些血樣？
紅細(xì)胞葉酸（臨床）：采空腹靜脈血，全血需經(jīng)溶血后制成溶血樣本，用于紅細(xì)胞葉酸的測定（WS/T 600-2018）。注意，這樣處理后測到的紅細(xì)胞中葉酸，嚴(yán)格意義上來說是紅細(xì)胞和血漿中葉酸之和。那檢測哪些指標(biāo)呢？居然包括非代謝性型葉酸（UMFA）、四氫葉酸（THF）、5,10-亞甲基四氫葉酸（5,10-CH2-THF）、5-甲醛四氫葉酸等多種葉酸形式之和，也稱為總?cè)~酸。臨床實(shí)驗(yàn)室主要使用蛋白結(jié)合法檢測，在此之前則使用微生物分析法進(jìn)行檢測，這兩種方法都無法區(qū)分單種葉酸（DOI：0.3969/j.issn.1673-8640.2016.03.019）。葉酸缺乏的閾值為紅細(xì)胞總?cè)~酸<340 nmol/L（151 ng/ml）。
血清葉酸（臨床）：采集血清后，使用蛋白結(jié)合法檢測總?cè)~酸，葉酸缺乏的閾值為血清總?cè)~酸<10 nmol/L（4 ng/ml）。注意，溶血樣本不能用于血清葉酸的測定，溶血樣本中因紅細(xì)胞中葉酸溶出致血清葉酸顯著升高。
血漿葉酸（臨床）：采集血漿后，使用蛋白結(jié)合法檢測總?cè)~酸。注意，溶血樣本不能用于血漿葉酸的測定，溶血樣本中因紅細(xì)胞中葉酸溶出致血漿葉酸顯著升高。
葉酸（科研）：一般采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測葉酸。更為靈敏和特異，可以定量檢測各個單種葉酸的濃度。但是葉酸化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，也對檢測構(gòu)成一定挑戰(zhàn)。檢測的樣品類型可以覆蓋全血、紅細(xì)胞、血清、血漿等，但是科研檢測時指的紅細(xì)胞，往往就只單指紅細(xì)胞，除了需要使用新鮮的全血樣本分離紅細(xì)胞，還需要記錄全血的體積，并檢測紅細(xì)胞壓積來用于紅細(xì)胞中葉酸的定量計(jì)算，單位往往是ng/mL或nmol/L。有的科學(xué)研究中也直接使用紅細(xì)胞體積用于定量計(jì)算。
質(zhì)譜法與微生物法或蛋白結(jié)合法進(jìn)行比較時，需要定義質(zhì)譜法總?cè)~酸的組成。根據(jù)目前實(shí)驗(yàn)室檢測能力，質(zhì)譜法總?cè)~酸一般包括FA、5MeTHF和5FoTHF（DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20200519-00481）。
血樣的保存條件和時間？
紅細(xì)胞葉酸（臨床）：制成溶血樣本前的全血，保存條件是20℃~25℃下2h，2℃~8℃下24h，-20℃下可穩(wěn)定1個月（僅適用于含K3EDTA抗凝劑的血樣），用于測定紅細(xì)胞用的溶血樣本，-20℃穩(wěn)定1個月，限一次凍融（WS/T 600-2018）。
血清葉酸（臨床）：在15℃~25℃可穩(wěn)定2h，2℃~8℃可穩(wěn)定48h，-25℃~-15℃可穩(wěn)定28d，只可凍融1次。避光保存。若標(biāo)本不能及時檢測，建議于-70℃條件下存放標(biāo)本，限一次凍融。
血漿葉酸（臨床）：在15℃~25℃可穩(wěn)定2h，2℃~8℃可穩(wěn)定48h，-25℃~-15℃可穩(wěn)定28d，只可凍融1次。避光保存。如果不能立即測量，將樣品于2℃~8℃儲存。
科研檢測樣本，要求在樣品收集過程中要盡可能減少較高溫度（如室溫）暴露時間、避免開放式放置，保存在-80℃條件下，避免凍融。
葉酸的結(jié)構(gòu)和存在形式？
葉酸是食物中自然存在的一類水溶性B族維生素的總稱，自然存在的葉酸大多數(shù)是蝶酰多谷氨酸。蝶酰谷氨酸（folic acid，F(xiàn)A）是葉酸的完全氧化形式，也是最常用的葉酸補(bǔ)充劑，由喋啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸組成。FA為人工合成品，本身不具有輔酶活性。FA被人體攝入后，在二氫葉酸還原酶的兩次還原作用下，先后還原為二氫葉酸（dihydrofolate，DHF）和四氫葉酸（tetrahydrofolate，THF），后者為一碳單位代謝的輔酶。THF的N5位和N10位被不同氧化水平的一碳單位取代基占據(jù)，形成的主要代謝物包括5-甲�；臍淙~酸（5-formytetrahydrofolate，5FoTHF）、10-甲�；臍淙~酸、5，10-亞甲基四氫葉酸、5，10-次甲基四氫葉酸和5-甲基四氫葉酸（5-methyltetrahydrofolate，5MeTHF）。其中，5MeTHF在人體內(nèi)含量最高，占比約是82%~93%（DOI：10.3760/cma.j.cn114452-20200519-00481）。超過95％的葉酸存在于紅細(xì)胞中（Gunter, 1996）。
血清或血漿葉酸水平反映短期個體葉酸儲量，受近期攝入影響，紅細(xì)胞葉酸更能真實(shí)反映出組織內(nèi)葉酸水平，檢測前需要進(jìn)行血細(xì)胞溶血，方法間差異大（DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20200519-00481）。葉酸結(jié)果只能同類型樣本相比較，也只能同種檢測方法相比較。
測哪種葉酸？
如果是用臨床上微生物法或蛋白結(jié)合法進(jìn)行檢測，目標(biāo)物不可更改，只能是總?cè)~酸。如果是用質(zhì)譜法進(jìn)行科研探索，在目標(biāo)明確的情況下，可以僅檢測感興趣的單體葉酸，進(jìn)行靶向定量檢測。
至于活性葉酸、非活性葉酸等名稱，主要圍繞妊娠期的營養(yǎng)補(bǔ)充劑類型展開，將主要成分是5-MTHF定義為活性葉酸，將主要成分是蝶酰谷氨酸（葉酸，VB9）的定義為普通葉酸，并倡導(dǎo)孕婦進(jìn)行補(bǔ)充。至于打出天然葉酸招牌的，基本上不太用理會。
總而言之，用什么樣品類型？測哪些葉酸？用什么方法測？取決于研究的具體目的和需求，并沒有完全絕對的結(jié)論。
參考文獻(xiàn)：
1.WS/T 600-2018人群葉酸缺乏篩查方法
2.血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸檢測的臨床應(yīng)用，陳樸、潘柏申，檢測醫(yī)學(xué)，2016年3月第31卷第3期。
3.葉酸檢測標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀及挑戰(zhàn)，易喜連、張江濤、張傳寶，中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2020年12月第43卷第12期。
4.Results of an international round robin for serum and whole-blood folate. Gunter EW, Bowman BA, Caudill SP, et al. Clin Chem 1996; 42(10): 1689-1694.
